Produkter
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detekteringskit för 2019-nCoV
Förväntad användning
Detta kit används för kvalitativ detektion av det nya coronaviruset (2019-nCoV) med hjälp av halsprover, nasofaryngeala prover, bronkoalveolär lavagevätska och sputum. Detektionsresultatet för denna produkt är endast för klinisk referens och bör inte användas som enda bevis för klinisk diagnos och behandling. En omfattande analys av tillståndet rekommenderas i kombination med patientens kliniska manifestationer och andra laboratorietester.
Inspektionsprincipen
Kitet är baserat på enstegs-RT-PCR-teknik. Faktum är att ORF1ab- och N-generna för det nya coronaviruset 2019 (2019-nCoV) valdes ut som amplifieringsmålregioner. Specifika primers och fluorescerande prober (N-genprober är märkta med FAM och ORF1ab-prober är märkta med HEX) är utformade för att detektera RNA för det nya coronaviruset 2019 i prover. Kitet innehåller också ett endogent internt kontrolldetekteringssystem (intern kontrollgenprob märkt med CY5) för att övervaka processen för provinsamling, RNA och PCR-amplifiering, och därigenom minska falskt negativa resultat.
Huvudkomponenter
| Komponenter | Volym(or)48T/Kit） |
| RT-PCR-reaktionslösning | 96 µl |
| nCOV-primer TaqMan-probblandning (ORF1ab, N-gen, RNAseP-gen) | 864 µl |
| Negativ kontroll | 1500 µl |
| nCOV positiv kontroll（l ORF1ab N-gen） | 1500 µl |
Egna reagenser: RNA-extraktions- eller reningsreagenser. Negativ/positiv kontroll: Den positiva kontrollen är RNA som innehåller målfragmentet, medan den negativa kontrollen är nukleinsyrafritt vatten. Under användning bör de delta i extraktionen och betraktas som smittsamma. De bör hanteras och kasseras i enlighet med relevanta föreskrifter.
Den interna referensgenen är den humana RnaseP-genen.
Förvaringsförhållanden och utgångsdatum
-20 ± 5 ℃, undvik upprepad frysning och upptining mer än 5 gånger, giltig i 6 månader.
Tillämpligt instrument
Med FAM / HEX / CY5 och andra flerkanaliga fluorescerande PCR-instrument.
Krav för provexemplar
1. Tillämpliga provtyper: halsprover, nasofaryngeala prover, bronkoalveolär lavagevätska, sputum.
2. Provtagning (aseptisk teknik)
Faryngeala provtagningspinne: Torka av tonsillerna och den bakre svalgväggen med två provtagningspinnar samtidigt, och sänk sedan ner provtagningspinnen i ett provrör som innehåller provtagningslösningen.
Sputum: Efter att patienten har haft en djup hosta, samla upp det hostade sputumet i ett provrör med skruvkork innehållande provtagningslösningen; bronkoalveolär lavagevätska: Provtagning av läkare. 3. Förvaring och transport av prover
Prover för virusisolering och RNA-testning bör testas så snart som möjligt. Prover som kan detekteras inom 24 timmar kan förvaras vid 4 ℃; de som inte kan detekteras inom 24
timmar bör förvaras vid -70 ℃ eller lägre (om det inte finns någon lagringsmiljö på -70 ℃ bör de
tillfälligt förvaring vid -20℃ i kylskåp). Prover bör undvika upprepad frysning och upptining under transport. Prover bör skickas till laboratoriet så snart som möjligt efter provtagning. Om prover behöver transporteras över långa sträckor rekommenderas torrisförvaring.
Testmetoder
1 Provbearbetning och RNA-extraktion (provbearbetningsområde)
Det rekommenderas att ta 200 μl flytande prov för RNA-extraktion. För relaterade extraktionssteg, se instruktionerna för kommersiella RNA-extraktionskit. Både negativa och negativa
Kontrollerna i detta kit var involverade i extraktionen.
2 PCR-reagensförberedelse (reagensförberedelseområde)
2.1 Ta ut alla komponenter ur kitet och tina och blanda i rumstemperatur. Centrifugera vid 8 000 rpm i några sekunder före användning; beräkna den erforderliga mängden reagenser och reaktionssystemet förbereds enligt följande tabell:
| Komponenter | N portion (25µl system) |
| nCOV-primer TaqMan-probblandning | 18 µl × N |
| RT-PCR-reaktionslösning | 2 µl × N |
| *N = antal testade prover + 1 (negativ kontroll) + 1 (nCOVpositiv kontroll) | |
2.2 Efter noggrann blandning av komponenterna, centrifugera en kort stund så att all vätska på rörväggen faller ner till botten av röret och alikvotera sedan 20 µl amplifieringssystemet i PCR-röret.
3 Provtagning (område för provberedning)
Tillsätt 5 μl av de negativa och positiva kontrollerna efter extraktion. RNA från provet som ska testas tillsätts till PCR-reaktionsröret.
Förslut röret ordentligt och centrifugera vid 8 000 rpm i några sekunder innan det överförs till amplifieringsdetekteringsområdet.
4 PCR-amplifiering (amplifierat detektionsområde)
4.1 Placera reaktionsröret i instrumentets provcell och ställ in parametrarna enligt följande:
| etapp | Cykel antal | Temperatur(°C) | Tid | samlingplats |
| Motsatttranskription | 1 | 42 | 10 minuter | - |
| Fördenatureringn | 1 | 95 | 1 minut | - |
| Cykel | 45 | 95 | 15-talet | - |
| 60 | 30-talet | datainsamling |
Val av instrumentdetekteringskanal: Välj FAM, HEX och CY5-kanalen för fluorescenssignalen. För referensfluorescens NONE, välj inte ROX.
5 Resultatanalys (Se de experimentella instruktionerna för varje instrument för inställning)
Spara resultaten efter reaktionen. Efter analysen justerar du startvärdet, slutvärdet och tröskelvärdet för baslinjen enligt bilden (användaren kan justera efter den faktiska situationen, startvärdet kan ställas in på 3~15, slutvärdet kan ställas in på 5~20, justering) i den logaritmiska grafen. Vid fönstrets tröskel är tröskellinjen i den logaritmiska fasen, och amplifieringskurvan för den negativa kontrollen är en rak linje eller under tröskellinjen.
6 Kvantitetskontroll (En procedurkontroll ingår i testet) Negativ kontroll: Ingen uppenbar amplifieringskurva för FAM-, HEX- och CY5-detektionskanalerna
COV positiv kontroll: tydlig amplifieringskurva för FAM- och HEX-detektionskanaler, Ct-värde ≤ 32, men ingen amplifieringskurva för CY5-kanalen;
Ovanstående krav måste uppfyllas samtidigt i samma experiment; annars är experimentet ogiltigt och måste upprepas.
7 Bestämning av resultat.
7.1 Om det inte finns någon amplifieringskurva eller ett Ct-värde > 40 i FAM- och HEX-kanalerna i testprovet, och det finns en amplifieringskurva i CY5-kanalen, kan man bedöma att det inte finns något RNA från det nya coronaviruset 2019 (2019-nCoV) i provet;
.2 Om testprovet har tydliga amplifieringskurvor i FAM- och HEX-kanalerna, och Ct-värdet är ≤40, kan det bedömas att provet är positivt för det nya coronaviruset från 2019 (2019-nCoV).
7.3 Om testprovet endast har en tydlig amplifieringskurva i en kanal av FAM eller HEX, och Ct-värdet är ≤40, och det inte finns någon amplifieringskurva i den andra kanalen, måste resultaten testas på nytt. Om resultaten av omtestet är överensstämmande kan provet bedömas som positivt för det nya testet.
coronavirus 2019 (2019-nCoV). Om resultatet av det nya testet är negativt kan man bedöma att provet är negativt för det nya coronaviruset 2019 (2019-nCoV).
Positivt omdömesvärde
ROC-kurvmetoden används för att bestämma referens-CT-värdet för kitet och det interna kontrollreferensvärdet är 40.
Tolkning av testresultat
1. Varje experiment bör testas för negativa och positiva kontroller. Testresultat kan endast fastställas när kontrollerna uppfyller kvalitetskontrollkraven.
2. När FAM- och HEX-detekteringskanalerna är positiva kan resultatet från CY5-kanalen (intern kontrollkanal) vara negativt på grund av systemkonkurrens.
3. När det interna kontrollresultatet är negativt, om provrörets FAM- och HEX-detektionskanaler också är negativa, betyder det att systemet är inaktiverat eller att funktionen är felaktig, och testet är ogiltigt. Därför måste proverna testas om.
