Produkter
Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR-detektionskit för 2019-nCoV
Förväntad användning
Detta kit används för kvalitativ detektering av nytt coronavirus (2019-nCoV) med hjälp av svalgpinnar, nasofaryngeala pinnar, bronkoalveolär sköljvätska, sputum. Detekteringsresultatet för denna produkt är endast för klinisk referens, och det bör inte användas som det enda bevis för klinisk diagnos och behandling.En omfattande analys av tillståndet rekommenderas i kombination med patientens kliniska manifestationer och andra laboratorietester.
Besiktningsprincip
Satsen är baserad på enstegs RT-PCR-teknik.Faktum är att 2019 års nya coronavirus (2019-nCoV) ORF1ab- och N-gener valdes ut som amplifieringsmålregionerna.Specifika primrar och fluorescerande prober (N-gensonder är märkta med FAM och ORF1ab-prober är märkta med HEX) är designade för att detektera 2019 ny typ av coronavirus-RNA i prover.Kitet innehåller också ett endogent internkontrolldetektionssystem (intern kontrollgenprob märkt med CY5) för att övervaka processen för provtagning, RNA- och PCR-amplifiering, och därigenom minska falskt negativa resultat.
Huvudkomponenter
| Komponenter | Volym(48T/Kit） |
| RT-PCR-reaktionslösning | 96 ul |
| nCOV-primer TaqMan-probblandning (ORF1ab, N-gen, RNAseP-gen) | 864 ul |
| Negativ kontroll | 1500 ul |
| nCOV positiv kontroll（l ORF1ab N-gen） | 1500 ul |
Egna reagenser: RNA-extraktion eller reningsreagens.Negativ/positiv kontroll: Den positiva kontrollen är RNA som innehåller målfragmentet, medan den negativa kontrollen är nukleinsyrafritt vatten.Under användning bör de delta i utvinningen och bör anses vara smittsamma.De ska hanteras och kasseras i enlighet med gällande föreskrifter.
Den interna referensgenen är den humana RNAseP-genen.
Förvaringsvillkor och utgångsdatum
-20±5 ℃, undvik upprepad frysning och upptining mer än 5 gånger, giltigt i 6 månader.
Tillämpligt instrument
Med FAM / HEX / CY5 och andra flerkanaliga fluorescerande PCR-instrument.
Krav på prov
1. Tillämpliga provtyper: svalgpinnar, nasofaryngeala pinnprover, bronkoalveolär sköljvätska, sputum.
2. Provinsamling (aseptisk teknik)
Svelgpinne: Torka av tonsillerna och den bakre svalgväggen med två svabbservetter samtidigt, sänk sedan ner pinnens huvud i ett provrör som innehåller provtagningslösningen
Sputum: Efter att patienten har en djup hosta, samla upp det hostade sputumet i ett provrör med skruvlock som innehåller provtagningslösningen;bronkoalveolär sköljvätska: Provtagning av medicinsk personal.3. Förvaring och transport av prover
Prover för virusisolering och RNA-testning bör testas så snart som möjligt.Prover som kan detekteras inom 24 timmar kan förvaras vid 4 ℃;de som inte kan upptäckas inom 24
timmar bör förvaras vid -70 ℃ eller lägre (om det inte finns något lagringsförhållande på -70 ℃ bör de vara
tillfälligt förvarad i -20℃kylskåp).Prover bör undvika upprepad frysning och upptining under transport.Prover ska skickas till laboratoriet så snart som möjligt efter insamling.Om prover behöver transporteras över långa sträckor rekommenderas torrisförvaring.
Testmetoder
1 Provbearbetning och RNA-extraktion (provbehandlingsområde)
Det rekommenderas att ta 200 μl vätskeprov för RNA-extraktion.För relaterade extraktionssteg, se instruktionerna för kommersiella RNA-extraktionssatser.Både det negativa och negativa
kontroller i detta kit var involverade i extraktionen.
2 PCR-reagensberedning (reagensberedningsområde)
2.1 Ta bort alla komponenter från satsen och tina och blanda i rumstemperatur.Centrifugera vid 8 000 rpm i några sekunder före användning;beräkna den erforderliga mängden reagens, och reaktionssystemet förbereds enligt följande tabell:
| Komponenter | N-portion (25 µl system) |
| nCOV-primer TaqMan-probblandning | 18 µl × N |
| RT-PCR-reaktionslösning | 2 µl × N |
| *N = antal testade prover + 1 (negativ kontroll) + 1 (nCOVpositiv kontroll) | |
2.2 Efter att ha blandat komponenterna noggrant, centrifugera en kort tid för att låta all vätska på rörväggen falla till botten av röret, och alikvotera sedan 20 µl amplifieringssystemet i PCR-röret.
3 Provtagning (provberedningsområde)
Tillsätt 5 μl av de negativa och positiva kontrollerna efter extraktion.RNA från provet som ska testas läggs till PCR-reaktionsröret.
Lock röret ordentligt och centrifugera vid 8 000 rpm i några sekunder innan du överför det till amplifieringsdetektionsområdet.
4 PCR-amplifiering (förstärkt detektionsområde)
4.1 Placera reaktionsröret i instrumentets provcell och ställ in parametrarna enligt följande:
| skede | Cykel siffra | Temperatur(°C) | Tid | samlingwebbplats |
| Omvändtranskription | 1 | 42 | 10 minuter | - |
| Fördenatureringn | 1 | 95 | 1 min | - |
| Cykel | 45 | 95 | 15 s | - |
| 60 | 30-talet | datainsamling |
Val av instrumentdetektionskanal: Välj FAM、HEX、CY5-kanalen för fluorescenssignalen.För referensfluorescerande INGEN, välj inte ROX.
5 Resultatanalys (se experimentinstruktionerna för varje instrument för inställning)
Efter reaktionen sparar du resultaten.Efter analys, justera startvärdet, slutvärdet och tröskelvärdet för baslinjen enligt bilden (användaren kan justera enligt den faktiska situationen, startvärdet kan ställas in till 3~15, slutvärdet kan ställas in på 5~20, justering) i den logaritmiska grafen. Vid fönstrets tröskel är tröskellinjen i logaritmfasen, och förstärkningskurvan för den negativa kontrollen är en rät linje eller under tröskellinjen).
6 Quautity control (En procedurkontroll ingår i testet) Negativ kontroll: Ingen uppenbar förstärkningskurva för FAM, HEX, CY5 detektionskanalern
COV positiv kontroll: uppenbar amplifieringskurva för FAM- och HEX-detektionskanaler, Ct-värde ≤32, men ingen amplifieringskurva för CY5-kanal;
Ovanstående krav måste uppfyllas samtidigt i samma experiment;annars är experimentet ogiltigt och måste upprepas.
7 Bestämning av resultat.
7.1 Om det inte finns någon amplifieringskurva eller Ct-värde > 40 i FAM- och HEX-kanalerna i testprovet, och det finns en amplifieringskurva i CY5-kanalen, kan det bedömas att det inte finns något nytt coronavirus från 2019 (2019-nCoV) RNA i provet;
.2 Om testprovet har uppenbara amplifieringskurvor i FAM- och HEX-kanalerna och Ct-värdet är ≤40, kan det bedömas att provet är positivt för 2019 års nya coronavirus (2019-nCoV).
7.3 Om testprovet har en tydlig amplifieringskurva endast i en kanal av FAM eller HEX, och Ct-värdet är ≤40, och det inte finns någon amplifieringskurva i den andra kanalen, måste resultaten testas igen.Om retestresultaten är konsekventa kan provet bedömas vara positivt för det nya
coronavirus 2019 (2019-nCoV).Om omtestresultatet är negativt kan det bedömas att provet är negativt för 2019 års nya coronavirus (2019-nCoV).
Positivt omdömesvärde
ROC-kurvmetoden används för att bestämma satsens referens-CT-värde och referensvärdet för intern kontroll är 40.
Tolkning av testresultat
1. Varje experiment bör testas för negativa och positiva kontroller.Testresultat kan endast fastställas när kontroller uppfyller kvalitetskontrollkraven
2. När FAM- och HEX-detekteringskanalerna är positiva kan resultatet från CY5-kanalen (intern kontrollkanal) vara negativt på grund av systemkonkurrens.
3.När det interna kontrollresultatet är negativt, om provrörets FAM- och HEX-detektionskanaler också är negativa, betyder det att systemet är inaktiverat eller att funktionen är felaktig, t är testet ogiltigt.Därför måste proverna testas igen.
